Calendário científico setembro 2023
Identificação da LLC através de duas tecnologias complementares
Como é que se podem identificar linfócitos anormais através de técnicas diferentes?
Com relação ao seu conteúdo ARN/ADN nos canais WDF e WPC do XN-Series
Detetando um fenótipo linfocitário anormal através de imunofenotipagem por citometria de fluxo
Com base em características morfológicas tais como razão NC elevada, núcleo oval e cromatina nuclear agregada heterogénea
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Referências
[1] WHO (2017): Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition, Volume 2
[2] Rozman C et al. (1995): Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 333(16): 1052-1057.
[3] Lanasa MC et al. (2010): Novel insights into the biology of CLL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010:70-6.
[4] NIH National Cancer Institute (1975-2007): SEER Cancer Statistics Review.
[5] Rawstron AC et al. (2017): Reproducible diagnosis of chronic lymphocytic leukemia by flow cytometry: An European Research Initiative on CLL (ERIC) & European Society for Clinical Cell Analysis (ESCCA) Harmonisation project. Cytometry B Clin Cytom. 94(1): 121-128.
[6] Marionneaux SM et al. (2021): Smudge Cells in Chronic Lymphocytic Leukemia: Pathophysiology, Laboratory Considerations, and Clinical Significance. Lab Med. 52(5): 426-438.
Informação científica de suporte
A leucemia linfocítica crónica (LLC) é um tipo de linfoma maligno. A OMS classifica a LLC como uma neoplasia de células B maduras, envolvendo principalmente o sangue periférico, a medula óssea e, adicionalmente, os gânglios linfáticos, o fígado e o baço [1]. Com uma incidência de 2 a 6 casos por 100.000 pessoas por ano no mundo ocidental, é a forma mais comum de leucemia em adultos [2] e o tipo mais prevalente, devido à sobrevivência relativamente longa dos doentes [3,4].
Uma aparência predominantemente monomórfica dos linfócitos sugere frequentemente uma população celular neoplásica e clonal. Como observado numa LLC típica, os linfócitos anormais são geralmente células pequenas de aparência madura, com baixa atividade mitótica [1].
Com exceção das células natural killer (NK), a linhagem dos linfócitos não pode ser determinada de forma fiável através de uma coloração de Pappenheim, e apenas algumas observações podem ser feitas morfologicamente. Para determinar os linfócitos de forma fiável, é necessária a imunofenotipagem. Os linfócitos anormais na LLC expressam os antigénios de superfície CD19, CD20, CD5, CD23, CD43 e CD200 com expressão de cadeias leves kappa ou lambda [5]. O CD10 é negativo.
Contexto de caso
Um doente consultou o médico de família devido a um mal-estar. Foi recolhida uma amostra de sangue periférico e enviada para o laboratório. A análise inicial com um analisador XN-20 revelou uma contagem normal de plaquetas e ausência de anemia, mas revelou uma linfocitose com a presença de células potencialmente malignas. O médico enviou a amostra para o laboratório de citometria de fluxo para análise por imunofenotipagem. A amostra foi avaliada num analisador XF-1600 e verificou-se a positividade para CD19, CD5, CD20, CD23, CD79b e uma proliferação monoclonal de cadeias leves lambda.
Além disso, foi realizado um esfregaço sanguíneo, o qual foi avaliado no analisador de imagem digital automatizado DI-60. A análise do esfregaço revelou linfócitos pequenos com uma razão núcleo-citoplasma elevada e um padrão nuclear de cromatina condensada. No esfregaço, também estavam presentes manchas de Gumprecht (smudge cells), o que é típico em doentes com leucemia linfocítica crónica [6].
Interpretação dos diagramas de dispersão e da morfologia
A análise do sangue do doente revelou um aumento acentuado da contagem de leucócitos para 26,17 x103/µl, dos quais 80% eram linfócitos (Linf# 21,15 x103/µl). Tal é visível no diagrama de dispersão WDF, onde a população de linfócitos se apresenta como uma nuvem muito densa.
Os reagentes usados no canal WPC têm um efeito de lise mais forte nas membranas dos leucócitos do que os usados no canal WDF, o que leva a uma maior permeabilidade celular. O marcador fluorescente específico usado no canal WPC marca o ADN dentro do núcleo da célula. Quanto maior o grau de permeabilização, mais marcador fluorescente pode entrar na célula e ligar-se ao ADN, causando um sinal fluorescente elevado. Os linfócitos neoplásicos, que são mais maduros, têm membranas facilmente permeáveis, devido ao maior teor de lípidos das membranas celulares, e portanto emitem um sinal fluorescente elevado. Isso pode ser observado no diagrama de dispersão WPC na Figura 1: a população de linfócitos neoplásicos forma um aglomerado de pontos vermelhos na área de fluorescência elevada do diagrama de dispersão WPC. A visualização SSC-FSC do diagrama de dispersão WPC mostra duas populações distintas de linfócitos (círculos azuis).
A análise morfológica usando um analisador de imagem digital automatizado DI-60 revelou a presença de manchas de Gumprecht (smudge cells).
Interpretação dos resultados de imunofenotipagem
A amostra foi pré-lavada antes da coloração, para excluir imunoglobulinas extrínsecas no plasma, que poderiam afetar os resultados finais. Seguidamente, foi realizado um protocolo de lise/lavagem. Em resumo:
- Foi colocado um cocktail de anticorpos num tubo de poliestireno de 75 mm x 12 mm
- Foram colocados 100 µl da amostra lavada no mesmo tubo e misturados em vórtex a 2500 rpm durante 5 segundos
- Incubação durante 15 minutos no escuro à temperatura ambiente
- Foram colocados 2 ml de CyLyse FX diluído numa razão de 1 para 10 no tubo, para efetuar a lise dos glóbulos vermelhos e fixar os glóbulos brancos, misturados em vórtex a 2500 rpm durante 5 segundos
- Incubação durante 10 minutos no escuro à temperatura ambiente
- A amostra foi então lavada duas vezes com PBS e colocada no XF-1600 para aquisição
As interações anticorpo/antigénio ocorrem na amostra e na mistura de cocktail para que os anticorpos monoclonais se liguem ao antigénio alvo específico na superfície da célula. Cada anticorpo monoclonal possui um marcador fluorescente que o citómetro de fluxo deteta, permitindo ao utilizador distinguir o que é positivo e negativo, facultando, assim, um diagnóstico.
O CyLyse FX é uma solução de lise à base de formaldeído que lisa os glóbulos vermelhos e fixa os glóbulos brancos com o anticorpo e o marcador ligados. Sem a lise, o citómetro de fluxo também adquiriria os glóbulos vermelhos, que não são relevantes para este teste.
Finalmente, a amostra é lavada para excluir os detritos dos glóbulos vermelhos antes da aquisição, o que permite ao utilizador obter uma imagem mais limpa durante a aquisição da amostra e garante uma análise de dados precisa.
Neste caso, a imunofenotipagem revelou uma linfocitose e uma população duplamente positiva CD19/CD5 com expressão reduzida. Além disso, foi observada uma proliferação monoclonal de cadeia leve lambda. A amostra também expressou CD20, CD23 e CD79b e foi negativa para CD10, CD11c e CD38, todos indicativos do diagnóstico de LLC B.
White paper
The white blood cell differential (WDF) channel utilises fluorescence markers that can separate different WBC subtypes according to their cell membrane composition and cytoplasmic content
